D-氨基酸是许多生物活性分子主要的手性结构单元，普遍应用于制药、化妆品、食物和农用化学品行业中。现在，合成D-氨基酸的生物催化要领较多，其中，使用D-氨基酸脱氢酶对α-酮酸举行还原胺化的要领具有较高的原子经济性和理论产率。然而自然的D-氨基酸脱氢酶十分希罕，而且主要以膜卵白的形式存在，难以实现工业化生产。

内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-diaminopimelatedehydrogenase,meso-DAPDH)是一种对α-酮酸的还原胺化反映具催化活性的D-氨基酸脱氢酶，详细反映蹊径如图1所示。

图1.meso-DAPDH催化α-酮酸的还原胺化反映

本文使用来自嗜热芽孢杆菌（Bacillusthermozeamaize）中的Ⅱ型内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶（BtDAPDH）作为模子，通过对其由内向外的分级刷新，以提高酶催化α-酮酸差池称合成D-氨基酸的活性。

详细研究历程如下：

（1）BtDAPDH的分级刷新及动力学特征研究

将底物和辅酶NADPH对接到BtDAPDH的活性中央，凭证底物苯甲酰甲酸的羰基碳和底物团结口袋区域的氨基酸Cα之间的距离，可将BtDAPDH的分为3层，选择用于诱变的氨基酸残基（共43个残基）展示如图2。

图2.BtDAPDH差异层中选定突变的氨基酸

对第一、二层选择的位点划分用差异于该位点的其余19个氨基酸举行替换，并对好的单点突变体举行组合，从而获得较优突变体M4（W129T/D134C/F154V/H235I）；继续以M4为出发模板，对第三层的26个候选位点举行饱和突变，经由筛选获得最优的突变体M5（W129T/D134C/F154V/S177A/H235I）。M5的催化活性比野生型酶提高了275倍（如图3），对100mM底物的转化率高达86%，且M5的动力学参数kcat/Km是野生型酶的125倍，热稳固性也有所提高。

图3.BtDAPDH突变体相对于野生型

(WT)的突变位点及相对活性

（2）BtDAPDH野生型酶(WT)及其突变体M5的底物谱研究

本文探讨了BtDAPDH野生型酶和最佳突变体M5的底物规模（如图4）。研究批注，突变体M5对芬芳族和脂肪族的α-酮酸都具有优异的催化活性和立体选择性，ee值均能到达99%。

图4.BtDAPDH野生型酶(WT)及其突变体M5的底物谱

（3）突变体M5性能改变的机理研究

为相识释突变体M5催化活性和稳固性提高的机制，划分将底物苯甲酰甲酸对接到M5和NADPH、WT与NADPH的复合晶体结构中（如图5），再举行MD模拟。效果显示，与野生型相比，突变体M5在亚胺中央体形成中体现出更近的距离（d2:4.7Åvs10.0Å）和亲核攻击（d1:3.9Åvs8.9Å），这些都有利于催化效率的提升。

突变体M5中F154V和H235I的突变，导致非极性氨基酸残基的疏水侧链细密相邻，形成疏水焦点区域，促进底物的团结；且H162可以与底物形成π−π群集相互作用，从而促进亚胺中央体的形成。这些构象调整有助于保持催化口袋的稳固性，防止结构冲突。

图5.底物苯甲酰甲酸划分与WT和NADPH（左）、M5和NADPH（右）的复合晶体结构

（4）突变体M5的反映条件优化

本文作者以苯甲酰甲酸为底物，对反映温度、pH、胺浓度、NADP+浓度等影响因素举行优化。由于甲酸脱氢酶(BstFDH)与DAPDH酶的偶联可有助于反映中NADPH辅因子的再生，会影响反映。因此，本文同时也对M5与BstFDH的投料比例举行了优化。

在5mL系统中，接纳补料分批方式，最佳反映条件为：温度30℃，pH10，1M甲酸胺，0.2mM的NADP+，M5和BstFDH的比例为1:12，反映24h后转化率高达99.5%。

（5）突变体M5的应用

本文将获得的BtDAPDH最佳突变体M5应用于合成左旋苯甘氨酸、苯丙氨酸和D-苯基丁氨酸（克级规模），产率均大于80%，ee值均大于99%（如图6）。

图6.使用BtDAPDH突变体M的应用案例

本文总结：本文通过对酶举行分级工程刷新，扩大了底物与酶的团结口袋，最终获得了具有高催化活性的最佳突变体BtDAPDH-M5。M5同时还具有优异的热稳固性和立体选择性，可有用催化概略积脂肪族和芬芳族类的α-酮酸举行的差池称还原胺化反映。

文章泉源：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.4c03164?fig=tgr1&ref=pdf.